BECOME A MEMBER
สมัคร ! สมาชิกชมรมรักสุขภาพ
ฟรี ข่าวสาระความรู้เรื่องสุขภาพ

Top  
wpe5.jpg (2068 bytes)

Browser คุณไม่ support Java / your browser does not support JAVA
จึงไม่สามารถแสดงผลได้

Wright-Giemsa Stain
สำหรับย้อมดูเม็ดเลือด แดง/ขาว เกล็ดเลือด / เชื้อมาลาเรีย

CBC Q-dip Stain
สำหรับย้อมดูลักษณะเม็ดเลือด แดง/ขาว เกล็ดเลือด
Gram's Stain
สำหรับย้อมดูลักษณะแยกเชื้อแบคทีเรีย จากสิ่งส่งตรวจ

Modify Kinyoun AFB Stain
สำหรับย้อมเพื่อตรวจหาเชื้อวัณโรค (TB) จากสิ่งตรวจ













Wright-Giemsa Stain

เป็นสีที่ใช้สำหรับย้อมดูเม็ดเลือดแดง  เม็ดเลือดขาว  และย้อม
ดูเชื้อมาลาเรีย        ประกอบด้วยสีสำคัญ 2 ตัวใหญ่ๆได้แก่ สี 
Wright stain และสี Giemsa stain  ส่วนของเม็ดเลือดที่มี
สภาพเป็นกรดเมื่อย้อมด้วย wright-geimsa stain จะถูกจับ
ด้วยส่วนที่เป็นด่างของสี ( basic dyes )ทำให้ส่วนนั้นติดสี
น้ำเงินหรือม่วง เช่นส่วนนิวเครียสของเม็ดเลือดขาว เป็นต้น
 
ส่วนของเม็ดเลือดที่มีสภาพเป็นด่าง เมื่อทำการย้อมแล้วจะจับกับ
ส่วนที่เป็นกรดของสี (acid dyes) ทำให้ส่วนนั้นๆติดสีแดง ชมพู เช่น granule ของเม็ดเลือดขาวชนิด 
eosinophile เป็นต้นส่วนของสี giemsa stain จะช่วยเสริมการติดสีของเม็ดเลือดแล้วยังช่วยย้อมเชื้อ
มาลาเรียให้เห็นชัดเจนมากขึ้น


ส่วนประกอบของชุดสีย้อม
- สี Wright-Giemsa stain ประกอบด้วย 0.3% Wright stain และ 0.1% Giemsa stain
  3% glycerine / 97% Methanol
- Phosphate buffer
- Fixative reagent

วิธีการย้อมสี
1. นำเลือดที่ต้องการย้อมมาทำเป็นแผ่นฟิลม์บางๆบนแผ่นกระจกใส ทิ้งไว้ให้แห้ง
2. นำแผ่นเลือดมาจุ่มลงใน Fixative reagent เพื่อคงรูปร่างของเม็ดเลือดก่อนย้อม ส่วนของ 
reagent นั้นหลังการใช้งานต้องรีบปิดฝาเพื่อป้องกันความชื้นในอากาศทำให้น้ำยา
     เสื่อมซึ่งจะมีผลทำให้เม็ดเลือดแดงเปลี่ยนรูปร่างได้

3. นำแผ่นเลือดไปจุ่มลงในสี Wright-Geimsa stain จับเวลานาน 1 นาที
4. นำแผ่นเลือดขึ้น แล้วนำไปจุ่มลงในขวด Phosphate buffer จับเวลานาน 1 นาที
5. ยกแผ่นเลือดขึ้น ล้างสีทีตกค้างด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำประปา เช็ดทำความสะอาดด้านหลังแผ่น
   

6. เป่าลมหรือผึ่งลมให้แห้ง นำไปส่องตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์

ดูภาพูลักษณะการย้อมสี

 
















CBC Q-dip Stain

เป็นสีที่ใช้สำหรับย้อมดูเม็ดเลือดแดง เม็ดเลือดขาว และย้อมเชื้อ
มาลาเรีย
แบบเร่งด่วน
ประกอบด้วยสีสำคัญ 2 ตัวใหญ่ๆได้แก่ สี Methylene blue 
และสี Safanine

ส่วนของเม็ดเลือดที่มีสภาพเป็นกรดเมื่อย้อมด้วย Q-dip stain 
จะถูกจับด้วยส่วนที่เป็นด่างของสี ( basic dyes )ทำให้ส่วนนั้น
ติดสีน้ำเงินหรือม่วง เช่นส่วนนิวเครียสของเม็ดเลือดขาว เป็นต้น

ส่วนของเม็ดเลือดที่มีสภาพเป็นด่าง เมื่อทำการย้อมแล้วจะจับกับส่วนที่เป็นกรดของสี (acid dyes)
ทำให้ส่วนนั้นๆติดสีแดง ชมพู เช่น granule ของเม็ดเลือดขาวชนิด eosinophile  เป็นต้น



ส่วนประกอบของชุดสีย้อม
- สี Methylene blue buffer
- สี Safranine  buffer
- Fixative reagent

วิธีการย้อมสี
1. นำเลือดที่ต้องการย้อมมาทำเป็นแผ่นฟิลม์บางๆบนแผ่นกระจกใส ทิ้งไว้ให้แห้ง
2. นำแผ่นเลือดมาจุ่มลงใน Fixative reagent เพื่อคงรูปร่างของเม็ดเลือดก่อนย้อม  ส่วนของ
    fixative reagent นั้นหลังการใช้งานต้องรีบปิดฝาเพื่อป้องกันความชื้นในอากาศทำให้น้ำยา
   เสื่อม ซึ่งจะมีผลทำให้เม็ดเลือดแดงเปลี่ยนรูปร่างได้
3. นำแผ่นเลือดไปจุ่มลงในสี   Methylene blue buffer ประมาณ 10-15 ครั้ง
4. นำแผ่นเลือดขึ้น แล้วนำไปจุ่มลงใน Safranine buffer ประมาณ 10-15 ครั้ง
5. ยกแผ่นเลือดขึ้น ล้างสีทีตกค้างด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำประปา เช็ดทำความสะอาดด้านหลัง
    แผ่นกระจก

6. เป่าลมหรือผึ่งลมให้แห้ง นำไปส่องตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์

ดูภาพูลักษณะการย้อมสี
















Gram's Stain

สี crystal violet จะซึมผ่านผนังเซลของแบคทีเรียเข้าไปใน 
cytoplasm ของแบคทีเรีย เมื่อทำการย้อมทับด้วย gram iodine
จะไปจับกับส่วนของ crystal violet เกิดเป็นสารประกอบเชิงซ้อน
เรียกว่า crystal-iodine complex ซึ่งมีขนาดโมเลกุลที่ใหญ่ขึ้น
 
ในแบคทีเรียชนิดแกรมบวก จะมีไขมันที่ผนังเซลน้อยกว่า
แบคทีเรียชนิดแกรมลบ
เมื่อล้างด้วย     Acetone-alcohol ซึ่ง
เป็นสารละลายไขมัน จะยังคงสามารถรักษาสารประกอบเชิงซ้อน
ได้อยู่ในแบคทีเรียชนิดแกรมลบ จะมีไขมันที่ผนังเซลมากกว่าแบบแกรมบวก เมื่อล้างด้วย Acetone-alcohol 
จะทำให้ผนังเซลแบคทีเรียเกิดช่องว่างขนาดใหญ่กว่า   ทำให้สารประกอบเชิงซ้อนหลุดออกจากเซลของ
แบคทีเรียได้
 เมื่อทำการย้อมทับด้วยสี safranine จึงทำให้แบคทีเรียแกรมลบติด
สีแดง ของ safranine
 ส่วนแบคทีเรียแกรมบวกซึ่งติดสี ม่วงน้ำเงิน  ของ Crystal violet อยู่แล้วจึงไม่ติดสีแดงของ safranine

ส่วนประกอบของชุดสีย้อม
- สี Crystal violet
- Gram Iodine
- Acetone-alcohol Decolorizer
- สี Safranine 

วิธีการย้อมสี
1. นำสิ่งตรวจที่ต้องการย้อมดูแบคทีเรีย มาทำ slide 
    smere เป็นวงบางๆบนแผ่นกระจกใส ทิ้งไว้ให้แห้ง 
    นำไปลนผ่านเปลวไฟ 2-3 ครั้งเพื่อช่วยให้แห้งและติด
    บนแผ่นกระจกดีขึ้น
2. ย้อมด้วยสี crystal violet นานประมาณ 1 นาที 
    ล้างออกด้วยน้ำ

3. ย้อมด้วย Gram-Iodine นานประมาณ 1 นาที 
    ล้างออกด้วยน้ำ

4. ล้างสีส่วนเกินออกด้วย Acetone-alcohol 
     decolorizer

5. ย้อมด้วยสี Safranine นานประมาณ 30 วินาที 
    ล้างออกด้วยน้ำ

6. เช็ดด้านหลังให้แห้ง   ผึงให้แห้ง แล้วนำไปส่องด้วย
    กล้องจุลทรรศน์
Gram's stain procedure
* Apply a thin film of the specimen to a clean 
   glass slide andallow it to air dry.
* Fix the slide in methanol for 1 minute. 
  Alternatively, fix byquickly passing the slide  
  through a flame several times.
* Flood the slide with crystal violet stain for 
   30 seconds.
* Rinse gently with running water.
* Flood the slide with Gram's iodine for 30 
   seconds.
* Rinse gently under running water.
* Apply decolorizer so it runs over the stained 
  area until nomore color washes out.
* Rinse gently with running water.
* Flood the slide with safranin counterstain for 
  30 seconds.* Rinse gently under running 
  water and allow the slide to air dry


laboratory staining technique that distinguishes between two groups of bacteria by the 
dentification of differences in the structure of their cell walls. The Gram stain, named 
after its developer, Danish bacteriologist Christian Gram, has become an important tool 
in bacterial taxonomy, distinguishing between so-called gram-positive bacteria, which 
remain colored after the staining procedure, and gram-negative bacteria, which do not 
retain dye. In the staining technique, cells on a microscope slide are heat-fixed (killed) 
and stained with a basic dye, crystal violet, which stains all bacterial cells blue; then 
they are treated with an iodine-potassium iodide solution that allows the iodine to enter 
the cells and form a water-insoluble complex with the crystal violet dye. The cells are 
treated with alcohol or acetone solvent in which the iodine-crystal violet complex is 
soluble. Following solvent treatment, only gram-positive cells remain stained, possibly 
because of their thick cell wall, which is not permeable to solvent. After the staining 
procedure, cells are treated with a counterstain, i.e., a red acidic dye such as safranin 
or acid fuchsin, in order to make gram-negative (decolorized) cells visible. Counterstained 
gram-negative cells appear red, and gram-positive cells remain blue. Although the 
cell walls of gram-negative and gram-positive bacteria are similar in chemical composition, 
the cell wall of gram-negative bacteria is a thin layer sandwiched between an outer 
lipid-containing cell envelope and the inner cell membrane, whereas the gram-positive 
cell wall is much thicker, lacks the cell envelope, and contains additional substances, 
such as teichoic acids, polymers composed of glycerol or ribitol. The difference in 
reactivity between gram-positive and gram-negative bacteria is linked with differences 
in physiological properties of the two groups. Gram-positive bacteria are generally more 
sensitive to growth inhibition by dyes, halogens, many antibiotics , and to attack by 
phagocytosis (see endocytosis ), and are more resistant to digestion by the enzymes 
pepsin
and trypsin and enzymes in animal sera.

GRAM STAIN TECHNIQUE

Overview

The Gram stain procedure was originally developed by the Danish physician Hans Christian Gram 
to differentiate pneumococci from Klebsiella pneumonia. In brief, the procedure involves the application of 
a solution of iodine (potassium iodide) to cells previously stained with crystal violet or gentian violet. This 
procedure produces "purple colored iodine-dye complexes" in the cytoplasm of bacteria. The cells that 
are previously stained with crystal violet and iodine are next treated with a decolonizing agent such as 95% 
ethanol or a mixture of acetone and alcohol. The difference between Gram-positive and Gram-negative 
bacteria is in the permeability of the cell wall to these "purple colored iodine-dye complexes" when treated 
with the decolorizing solvent. While Gram-positive bacteria retain purple iodine-dye complexes after the 
treatment with the decolorizing agent, Gram-negative bacteria do not retain complexes when decolorized. 
To visualize decolorized Gram-negative bacteria, a red counterstain such as safranin is used after 
decolorization treatment

Appearance of the Gram positive coccus and Gram negative bacillus at different stages of the gram staining 
procedure are illustrated below:

Preparation of the smear

The first consideration is the correct preparation of the smear. Make a thin film of the material on a clean 
glass slide, using a sterile loop or swab for viscous specimens. Air dry, then heat fix the slide by passing it 
several times through a flame (the slide should not become too hot to touch). Failure to follow these 
directions may cause staining artifacts and disrupt the normal morphology of bacteria and cells.

To be visible on a slide, organisms that stain by the Gram method must be present in concentrations of a 
minimum of 104 to 105 organisms/ml of unconcentrated staining fluid. At lower concentrations, the Gram stain 
of a clinical specimen seldom reveals organisms even if the culture is positive. Smears that are not 
properly fixed tend to be washed away during staining and washing resulting in the absence 
of stained bacteria
.

In special situations, the following guidelines may be helpful:

When cerebrospinal fluid contains only a few organisms, they are more likely to be found if a concentrated 
"thick smear" is examined. To prepare a "thick smear" the specimen is spun at high speed and a large drop 
of sediment (or multiple drops, drying in between each drop) is placed in the center of the slide and allowed 
to air dry. The cytocentrifuge may prove to be useful in concentrating bacteria as well as in preserving cell 
morphology.

 

When fluid specimens such as urine or CSF seem to vanish after the staining procedure, a wax mark, placed 
near the smeared area on the slide (same side) after the staining procedure (to avoid introducing wax artifacts) 
will reduce frustration in locating the specimen under the microscope. The wax mark can be used for quick 
focusing.

In a grossly bloody specimen, it may prove difficult to distinguish microorganisms from artifacts. After air-drying 
and heat-fixing this type of specimen, the added preparatory step of covering it with distilled water, waiting five 
minutes, and then rinsing, may cause the red blood cells to lyse and float off.

 

Staining procedure

 

  1. Flood slide with crystal (or gentian) violet- 10 seconds. (Wash with running tap water).
  2. Flood with Gram's iodine - 10 seconds. (Wash with water).
  3. Carefully decolorize with 95% ethanol until thinnest parts of the smear are colorless. (Wash with water).
    This third step is the most critical and also the one most affected by technical variations in timing and reagents.
  4. Flood with safranin (pink color) - 10 seconds. (Wash with water). Air dry, or blot with absorbent paper.

Results

As shown below, organisms that retain 
the violet-iodine complexes after washing in ethanol stain purple and are termed Gram-positive
those that lose this complex stain red from the safranin counterstain are termed Gram-negative.

 

Typical Gram stain
Gram positive Gram negative

 

ดูภาพูลักษณะการย้อมสี

















Modify Kinyoun AFB Stain

เชื้อวัณโรค (Mycobacterium tuberculosis) สาเหตุของโรค
วัณโรค ซึ่งเริ่มกลับมาระบาดมากขึ้นโดยเฉพาะในกลุ่มผู้ติดเชื้อ 
HIV   ตัวเชื้อวัณโรคมีคุณสมบัติพิเศษเฉพาะตัวก็คือ เป็นเชื้อที่
ทนต่อสภาพกรดได้ดีจึงมีเชื้อเรียกอีกอย่างว่า acid fast bacilli   
เนื่องจากที่ผนังเซลของเชื้อแบคทีเรียประกอบด้วยกรดไขมันสูง
ถึงร้อยละ 60 ของน้ำหนัก ทำให้การย้อมติดสียาก  แต่เมื่อย้อม
ติดสีแล้วกอรปกับคุณสมบัติที่ทนต่อกรด ดังนั้นเมื่อทำการล้างสี
ออกด้วย acid alcohol สีที่ติดกับแบคที่เรียชนิดอื่นๆจะถูกล้างออกได้โดยง่าย ยกเว้นสีที่ย้อมติดบน
เชื้อวัณโรค (TB) จะล้างออกยาก โดยจะเห็นเป็น สีแดง
และเมื่อย้อมทับด้วยสีน้ำเงินเพื่อให้เป็นสีพื้น
เพื่อตัดกับสีแดงของเชื้อวัณโรค จะช่วยให้สังเกตุเห็นง่ายมากขึ้น


ส่วนประกอบชุดน้ำยา
1. Kinyoun carbol fuchsin
2. Acid fast alcohol Decolorizer
3. Methylene blue

วิธีการย้อม
1. นำสิ่งส่งตรวจที่ต้องการย้อมเพื่อหาเชื้อวัณโรค ซึ่งส่วนใหญ่จะเป็น เสมหะ มาเกลี่ยเป็น
แผ่นบางๆบนกระจกย้อมเชื้อ (slide) ตั้งทิ้งไว้ให้แห้งในที่มิดชิด เพื่อป้องกันการฟุ้งกระจาย
ของเชื้อถ้ามีนำแผ่นกระจกไปลนผ่านไฟประมาณ 2-3 ครั้ง เพื่อช่วยให้แห้งและติดแผ่น
กระจกดีขึ้น

2. ย้อมด้วยสี Kinyoun carbol fuchsin นานประมาณ 5 นาที ล้างน้ำ
3. ล้างสีส่วนเกินออกด้วย Acid fast alcohol จนแผ่นย้อมมีสีติดน้อบลง
4. นำไปย้อมทับต่อด้วยสี Methylene blue นาน 5 นาที ล้างสีส่วน้กินออกด้วยน้ำประปา
5. เช็ดแผ่นกระจกให้สะอาด ผึ่งลมให้แห้ง   นำไปส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศ์

ดูภาพูลักษณะการย้อมสี



wpe5.jpg (2190 bytes)
ThaiL@bOnline - Crystal Diagnostics
Email : info@thailabonline.com

Phone : (02) 803-7310-11  Fax : (02) 803-6704


 






We subscribe to the
HONcode principle
of the Health on the
Net Foundation

  
About Us | Add URL I Privacy Policy | Member Register | Health Shop | Contact Us | Health Board | Advertising
Disease / Condition | Head Line News | Healthcare | Diagnostic | Alternative Medicine | Aromatherapy |
Health Game Zone


1999-2009 Thailabonline.com. All rights reserved. 
เลขทะเบียนพาณิชย์อิเล็กทรอนิกส์  e-Commerce Registration Number  7100803000130
By using this information service,    you accept the terms of our Visitor Agreement. Please read it. 
The material on Thailabonline.com and iHealthsite.net are for informational purposes only and is not 
a substitute for medical advice or treatment for any medical conditions.   You should promptly seek 
professional medical care if you have any concern about your health, and you should always consult 
your physician before starting a fitness regimen.
”Thailabonline.com” and “ihealthsite.net” and ”AromaEssence” and ”MedHealthMart” are trademarks of Crystal Diagnostics Co.,Ltd.